微生物檢測基礎(chǔ)知識及常見消毒滅菌方式

一、微生物的概念與分類

在自然界里，有許多肉眼不能直接看見，必須借助于顯微鏡放大才能觀察到微小生物，這些微小生物總稱為微生物。

微生物的分類，目前公認的包括七大類。即病毒→立克次體→支原體→細菌→放線菌→螺旋體→真菌（酵母菌、霉菌）。排在前面的小而低等，排在后面的逐漸大而高等，本文內(nèi)容只重點介紹三類。

二、微生物的特點

微生物除了個體微小、結(jié)構(gòu)簡單這一基本特征以外，還有一些其他特點也是與眾多生物不同的。

（一）種類繁多

微生物的數(shù)量和種類是十分驚人的。一滴水，一顆土粒往往都是一個微生物“社會”。其中以土壤內(nèi)的生存密度很大，1克較肥活的土壤常含有幾億到幾十億個微生物；貧瘠土壤每克也含有幾百萬到幾千萬個，一只骯臟的蒼蠅，全身能攜帶5億多個細菌。

三對足能粘附700萬至1000萬個細菌，可見微生物的密集度之大。微生物的各類也很可觀，自然界已知的微生物就有10萬種左右。

（二）分布廣泛

微生物是地球上分布很廣泛的一類生物。在遼闊的自然界中，無論土壤、水域、空氣以及動物、植物、人體內(nèi)外都有大量微生物存在。有些微生物能夠在異常的條件下生存，例如耐酸菌能在10%的硫酸溶液中生活，嗜熱菌能在溫度高達98℃以上的溫泉中生活，有的甚至在高達200～300℃的深?；鹕娇诟浇材芑顒樱塞}菌在含鹽量高達23%～25%的死海里，甚至30%的摘錄化鈉溶液中和鹽塊上存活，顯然這是一般生物所望塵莫及的。

（三）繁殖迅速

微生物的繁殖速度也是同樣驚人的，比高等動植物快得多，有些細菌，在適宜條件下每20分鐘就可以繁殖一次，例如大腸桿菌，1個細菌經(jīng)20分鐘就分裂成2個，每小時可分裂3次，這樣，1個細菌繁殖3代就產(chǎn)生8個細菌。即：

1小時            =8個

2小時            8×23=64個

3小時            64×23=512個

4小時            512×23=4096個

24小時          1×272=4.7*1021

照此速度繁殖下去，24小時就可繁殖72代，數(shù)量大約為4.7*1021個。所以細菌培養(yǎng)24小時就可以看見菌群。其增殖速率是相當(dāng)驚人的。但因種種條件（營養(yǎng)物質(zhì)）限制，這種繁殖速度是不能持久的。盡管如此，微生物這種快速繁殖能力應(yīng)用到工業(yè)發(fā)酵上，在短時間內(nèi)得到大量增殖，收或較多的產(chǎn)物，也是有著重要意義的。

三、常見的微生物

（一）細菌

細菌是能夠獨立地進行生長繁殖的單細胞生物，種類很多，大小不一，平均約1.0μm，用顯微鏡放大1000倍，也只有1.0mm大小，所以肉眼看不見。

細菌的形態(tài)是不完全相同的，一般可歸納為三種類型：

1.球菌  單獨存在時呈球形，按其分裂的方式和分裂后的排列，可分為單球菌、雙球菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、葡萄球菌等，菌體直徑約0.5～1.0μm。

2.桿菌  菌體呈桿狀或近似桿狀。大小、長短、粗細很不一致，有的粗短近似球菌，稱為球桿菌；有的桿菌一端膨大似棒狀，稱為棒狀桿菌；有的排列成鏈狀，稱為鏈桿菌；有的生長成側(cè)枝，稱為分枝桿菌。大部分桿菌長約2.0～3.0μm，寬0.5～1.0μm，病原細菌中桿菌的種類很多。

3.弧菌和螺菌  菌體呈彎曲或螺旋狀，只有一個彎曲，呈逗點狀為弧菌，如霍亂弧菌；有數(shù)個彎曲較為堅韌的為螺菌，如鼠咬熱螺菌。

（二）病毒

病毒是體積很小，結(jié)構(gòu)很簡單，沒有細胞結(jié)構(gòu)，而只能寄生在其它生物的細胞內(nèi)，利用宿主細胞的酶系統(tǒng)和營養(yǎng)物質(zhì)進行生長繁殖的原始生物。病毒的形態(tài)多數(shù)呈球形，少數(shù)呈桿狀或磚塊狀，細菌病毒（噬菌體）多數(shù)呈蝌蚪狀，平均大小只有0.1μm，比細菌約小10倍，小的病毒只有0.01μm，接近蛋白質(zhì)分子。病毒大多能通過濾菌器，故俗稱濾過性病毒。

 豬流感病毒

（三）真菌

真菌是體積較大，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的微生物。真菌在自然界里廣泛存在，如使衣物、食品發(fā)霉的霉菌，釀酒或發(fā)醇面粉的醇母菌都是真菌。病原真菌也較常見，如皮膚淺表的癬菌。真菌對熱的抵抗力不強，60℃加熱1小時即被殺死。真菌分單細胞真菌和多細胞真菌；單細胞真菌和多細胞真菌；單細胞真菌通稱為酵母菌。多細胞真菌通稱為霉菌。

四、細菌細胞的特殊結(jié)構(gòu)

有的細菌除具有上述基本結(jié)構(gòu)外，尚有某些特殊結(jié)構(gòu)，如莢膜、芽胞、鞭毛、菌毛等。

1.莢膜 

有些細菌在一定的營養(yǎng)條件下，向細胞壁表面分泌一種粘液狀物質(zhì)，形成一層較厚的膜（約0.2μm）稱為莢膜。莢膜中含有大量水分，莢膜對菌體有保護作用，可保護細菌抵抗干燥。細菌的莢膜與細菌的致病力有關(guān)，具有莢膜的細菌不易被白細胞所吞噬，故能在機體內(nèi)生長繁殖，引起感染。

2.芽胞

某些細胞生長到一定時期或當(dāng)外界條件改變時對細菌生長不利時，菌體內(nèi)的細胞漿發(fā)生脫水濃縮，逐漸形成圓形或橢圓形的小體，位于菌體中央或末端，稱為芽胞，如下圖所示，芽胞是細菌的休眠體，一個繁殖體只能形成一個芽胞。芽胞外部有數(shù)層厚而致密的膜，可抵御外界不良的環(huán)境，對于高溫、干燥、光線、化學(xué)藥品等有抵抗力比繁殖體為強，沒有形成芽胞的細菌，在70℃以上就逐漸死亡，而芽胞卻能抵抗100℃或更高一些的溫度。因此，殺死芽胞要比殺死細菌的繁殖體困難得多，有的芽胞存活多年而不喪失其活力，當(dāng)遇到合適條件又可生長繁殖，因此滅菌的效果應(yīng)以殺死芽胞為標(biāo)準。

五、細菌的生長繁殖和代謝產(chǎn)物

1.細菌的繁殖方式

細菌的繁殖方式是簡單無性二分裂法，即一個細菌分為二個，二個分為四個，如此繼續(xù)下去。球菌由于沿著一個平面或幾個平面，故呈鏈狀、葡萄狀、雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌等狀態(tài)；桿菌一般沿橫軸分裂。

大部分細菌的繁殖速度很快，如大腸桿菌在適宜的條件下，每20分鐘就可繁殖一代，若保持此速度繁殖10小時后，一個細菌可以繁殖10億個。細菌繁殖雖然如此迅速，但它是受各方面因素所制約，決不能無限制地繁殖下去。

2.生長繁殖的條件

1）  水  細菌的生長繁殖是從外界吸收營養(yǎng)物質(zhì)，通過本身含有的許多酶系統(tǒng)，進行一系列的生化反應(yīng)分解轉(zhuǎn)化成簡單物質(zhì)，然后加以吸收利用。水是細菌生活所不可缺水的物質(zhì)。

2）碳和氮化合物、無機鹽等  這些是細菌營養(yǎng)所必須的物質(zhì)。

3）氣體  氧、二氧化碳和氮與細菌的生長繁殖有密切的關(guān)系。有些細菌必須有充分的氧氣供應(yīng)才能生活，稱為需氧菌，如結(jié)核桿菌；另一類則恰相反，要在缺氧的環(huán)境下才能生活，有氧存在反而對它們生長不利，稱為厭氧菌，如破傷風(fēng)桿菌；大多數(shù)但致病菌處于這兩者之間，有氧無氧都生活的則稱為兼性厭氧菌，如大腸桿菌。

（4）酸堿度  大多數(shù)病原菌生長適宜的酸堿度為pH7.2～7.6。

（5）溫度  根據(jù)細菌對溫度要求的不同，可分為嗜冷菌、嗜溫菌及嗜熱菌。一般病原菌的適宜溫度基本與人類體溫相同，因而實驗室培養(yǎng)細菌均采用37℃。（霉菌25℃）

3.代謝產(chǎn)物

細菌在生長繁殖中，可產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，有的分泌到菌體外面，有的包含在菌內(nèi)，有一些代謝產(chǎn)物對人體有益，如抗生素、維生素等；但有一些代謝產(chǎn)物對人體是有害的，如熱原等，這些產(chǎn)物一旦進入機體可以致病或使體溫升高。

六、外界環(huán)境中對微生物生長的影響因素

1.溫度和化學(xué)因素  溫度和化學(xué)因素對微生物的生長繁殖影響極大，將在物理滅菌法和化學(xué)滅菌法中講述。

2.pH值  pH值對微生物生長的影響 ，中性繁殖很快。

3.濕度  溫度可以促使細菌生長，特別對霉菌繁育更快。因此防止?jié)穸冗^大對于避免染菌霉敗有一定的作用。

水的活度對細菌生長的重要性，提高食品成分結(jié)合水分能力從而改變水活度。

4.滲透壓  微生物的細胞具有半透膜的性質(zhì)，可以透水，但對于其他物質(zhì)的透過則有選擇性，低滲藥液可使細胞膜膨脹，但高透藥液可使細胞內(nèi)水分滲出而處于脫水狀態(tài)。所以一般微生物在濃鹽溶液或濃糖溶液中不易生長繁殖，就是由于細菌細胞內(nèi)水分滲出而脫水的緣故。如蔗糖是微生物的良好營養(yǎng)；單糖漿含蔗糖85%，為其等滲濃度9.25%的9倍多，卻能保持不長菌；若濃度不夠，容易長菌敗壞。

七、有關(guān)名詞解釋

滅菌  系指殺死或除去所有微生物的繁殖體和芽胞，使之完全無菌。

消毒  系指僅僅殺滅病原微生物，使之不成為傳染源。

殺菌  系指使用化學(xué)藥品或物理因素，對微生物在短時間內(nèi)起殺滅的作用。

抑菌  即抑制微生物繁殖體的生長及其繁殖。

防腐  系指防止或抑制微生物生長繁殖的方法。

無菌  系指沒有任何活的微生物存在。

八、物理滅菌法

（一）加熱滅菌法

加熱可破壞微生物中酶、蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致微生物死亡。加熱滅菌又分干熱滅菌法和濕熱滅菌法。在同一溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好。主要是因濕熱滅菌時，有水分存在，蛋白質(zhì)容易變性。水分又易使微生物膜壁潤濕，濕熱的穿透力比干熱大。

干熱滅菌法  常用的有火焰滅菌法與干熱空氣滅菌法兩種。

（二）紫外線滅菌法

是指用紫外線照射殺滅微生物的方法。一般用于滅菌的紫外線波長是200~300nm，滅菌力很強的波長是253.7nm。紫外線作用于核酸蛋白促使其變性，同時空氣受紫外線照射后產(chǎn)生微量臭氧，從而起共同殺菌作用。紫外線進行直線傳播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但較易穿透清潔空氣及純凈的水。因此本法適用于照射物體表面之滅菌、無菌室的空氣及水的滅菌；不適用于藥液的滅菌、固體物質(zhì)深部的滅菌；普通玻璃可吸收紫外線，因此裝于玻璃容器中的藥物不能用此法滅菌。紫外線對人體照射過久，會發(fā)生結(jié)膜炎，紅斑及皮膚燒灼等現(xiàn)象，故一般在人入室前開啟紫外線燈1~2小時，關(guān)閉后人才進入潔凈室。如果必須在人進去后仍要開紫外線滅菌，則人的皮膚及眼睛應(yīng)有有效的防護措施。一般在6~15m3的空間可裝置30瓦紫外線燈一盞，離地面2.5~3m為宜。

用紫外線照射滅菌時要注意下列問題：

1、紫外線的殺菌力，隨使用時間增加而減退，一般使用時間達到額定時間70%時應(yīng)更換紫外線燈管，以保證殺菌效果。國產(chǎn)紫外線燈平均壽命一般為2000h。

2、紫外線的殺菌作用隨菌種不同而不同，殺霉菌的照射量要比殺桿菌大40~50倍。

3、紫外線照射通常按相對濕度為60%的基礎(chǔ)設(shè)計，室內(nèi)濕度增加時，照射量應(yīng)相應(yīng)增加。

4、紫外線滅菌效果與照射的時間長短有關(guān)，這需要通過驗證來確定照射時間。

5、紫外照射燈的安裝形式及高度，應(yīng)根據(jù)實際情況,參考使用說明決定。

滅菌方法的驗證采用生物指示劑挑戰(zhàn)試驗，生物指示劑多用枯草芽孢桿菌。

（三）微波滅菌法

微波是指頻率在30~3000MHz之間的電磁波。水可強烈地吸收微波，使其極性分子轉(zhuǎn)動，分子間的磨擦而生熱，且升溫迅速，靠熱力而滅菌。在數(shù)十秒至幾分鐘之內(nèi)可達100～150℃，并全部殺死液體中的微生物，適于水溶性注射液的滅菌。另外，固體藥材飲片及固體制劑（丸劑、散劑、膠囊粉等）也含少量水分，微波能穿透到固體內(nèi)部，由表至里被均勻加熱，而起干燥、滅菌的作用。多用于口服液體制劑的滅菌，有望用于注射液的滅菌。但可能對某些藥品的PH值、含量、顏色有影響。

（四）輻射滅菌法

輻射滅菌是應(yīng)用γ射線、β射線殺滅細菌的方法，又稱電離輻射，前者由鈷-60或銫-137發(fā)出，穿透力強；后者由電子加速器產(chǎn)生，帶電荷，穿透力弱，滅菌效果差。

九、化學(xué)滅菌法

化學(xué)滅菌法系指用化學(xué)藥品來殺滅微生物的方法。同一種化學(xué)藥品的低濃度時呈現(xiàn)抑菌作用，而在高濃度時則能起殺菌作用。其殺菌機理可能是：能使微生物蛋白質(zhì)變性死亡，或與酶系統(tǒng)結(jié)合影響代謝，或改變膜壁通透性使微生物死亡等。常用的方法有消毒劑消毒法和化學(xué)氣體滅菌法等。

（一）消毒劑消毒法

消毒是指殺死病原微生物的方法。但化學(xué)消毒劑大多僅能殺死微生物的繁殖體而不能殺死芽孢，能控制一定范圍的無菌狀態(tài)?？蓪⑾緞┡涑蛇m宜濃度，采用噴淋、涂擦或浸泡等方法對物料、環(huán)境、器具等進行消毒。常用的化學(xué)消毒劑有0.1%～0.2%苯扎溴銨溶液、3%～5%的酚或煤酚皂溶液、75%乙醇等。常用于物體表面滅菌。但要注意其濃度不要過高，以防止化學(xué)腐蝕作用。潔凈室的墻面、天花板、門窗、機器設(shè)備、儀器、操作臺、車、桌、椅等表面以及人體雙手（手套）在環(huán)境驗證及日常生產(chǎn)時，應(yīng)定期清潔并用消毒劑噴灑，無菌室用的消毒劑必須在層流工作臺中，用0.22μm的濾膜過濾后方能使用。

（二）化學(xué)氣體滅菌法

系指利用化學(xué)藥品的氣體或產(chǎn)生的蒸汽進行殺滅微生物的方法。

1.環(huán)氧乙烷滅菌法 

環(huán)氧乙烷滅菌法是利用環(huán)氧乙烷氣體進行殺菌的方法。它是一種傳統(tǒng)的滅菌方法，可應(yīng)用于工衣滅菌、不耐加熱滅菌的藥品、醫(yī)用器具、設(shè)施、設(shè)備等的滅菌。

環(huán)氧乙烷滅菌系統(tǒng)，主要有下列四項互相制約的重要因素影響滅菌效果：

1、溫度；2、濕度；3、氣體濃度；4、滅菌時間。

因為環(huán)氧乙烷是易燃易爆物質(zhì)，明火可以引起燃燒，同時由于氣體分解還可能引起爆炸，環(huán)氧乙烷滅菌中應(yīng)十分注意安全問題。

2.甲醛等蒸汽熏蒸法 

采用甲醛、丙二醇或過氧醋酸等化學(xué)品，通過加熱產(chǎn)生蒸汽進行空氣環(huán)境滅菌。

(1)、計算房間體積，按10g/m3的比例稱出甲醛。

(2)、將甲醛倒入甲醛發(fā)生器或加熱盤或燒杯中，并放好加濕用水，必要時還需加入高錳酸鉀（2~3g/m3），然后加熱（甲醛發(fā)生器用蒸汽加熱，加熱盤或燒杯用熱水盛入其中加熱）使其蒸發(fā)成氣體。

(3)、滅菌流程：空調(diào)器停止運轉(zhuǎn)→啟動甲醛氣體發(fā)生器或在加熱盤中加熱甲醛  →讓甲醛氣體擴散約30分鐘→啟動空調(diào)器讓甲醛氣體循環(huán)約30分鐘→停止空調(diào)器，房間熏蒸消毒，時間不少于8小時→ 房間排氣，用新鮮空氣置換約2小時→ 恢復(fù)正常運行。

當(dāng)相對濕度在65%以上，溫度在24~40℃時，甲醛氣體的消毒效果很好。

3、臭氧消毒法

臭氧（O3）的消毒原理是：臭氧在常溫、常壓下分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，很快自行分解成氧（O2）和單個氧原子（O），后者具有很強的活性，對細菌有極強的氧化作用，臭氧氧化分解了細菌內(nèi)部氧化葡萄糖所必須的酶，從而破壞其細胞膜，將其殺死。多余的氧原子則會自行重新結(jié)合成為普遍氧分子（O2），不存在任何有害殘留物，故稱為無污染消毒劑。它不但對種種細菌（包括肝炎病毒、大腸桿菌、綠膿桿菌及雜菌等）有極強的殺滅能力，而且對霉菌也很有效。

十、無菌操作法

無菌操作室應(yīng)達到GMP的規(guī)定，為達無菌的要求可采取綜合措施：

①應(yīng)采用層流潔凈空氣技術(shù)；

②可采用甲醛等蒸汽熏蒸法消毒和紫外燈滅菌法進行空氣環(huán)境滅菌；

③室內(nèi)用具、墻、桌等暴露面用消毒劑噴、擦消毒；

④其他物品可熱壓或干熱法滅菌；

⑤操作人員衣、帽、鞋、手等消毒及滅菌。

無菌操作室應(yīng)定期進行菌落檢查。一般采用培養(yǎng)皿暴露20~30min，37℃培養(yǎng)48h，每只培養(yǎng)皿內(nèi)不超過3個菌落為合格。

十一、食品的防腐與防腐劑

微生物有水分及其他適宜條件就可以繁殖，很多食品易被微生物污染，所以除采用適當(dāng)方式滅菌外，可加防腐劑以抑、殺微生物。

防腐劑，又稱抑菌劑，系指能抑制微生物生長繁殖的物質(zhì)，常用的防腐劑有：

1.苯甲酸與苯甲酸鈉  為常用的有效防腐劑，一般用量為0.1%～.25%。苯甲酸水溶性較差，而苯甲酸鈉水溶性好，易溶解，應(yīng)用方便。

2.對羥基苯甲酸酯（尼泊金類）  有甲、乙、丙、丁四種酯，抑霉菌作用較強，一般用量為0.01%～0.25%。

3.山梨酸與山梨酸鉀  山梨酸的分子結(jié)構(gòu)式為CH3—CH=CH—CH=CH—COOH，常用濃度為0.15%～0.05%。對細菌和霉菌均有較強抑菌效力。

 4.其他  含20%以上乙醇、含30%以上的甘油、中藥中很多揮發(fā)油及0.1脫水醋酸等均有防腐效力。
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